分光光度法測定葉綠素含量

葉綠素廣泛存在于果蔬等綠色植物組織中，并在植物細胞中與蛋白質結合成葉綠體。當植物細胞死亡后，葉綠素即游離出來，游離葉綠素很不穩定，對光、熱較敏感；在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀堿液中可水解成鮮綠色的葉綠酸鹽以及葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a 和b，兩者均易溶于乙醇、乙-醚、丙酮和氯仿。

葉綠素的含量測定方法有多種，其中主要有：

1.原子吸收光譜法：通過測定鎂元素的含量，進而間接計算葉綠素的含量。

2.分光光度法：利用分光光度計測定葉綠素提取液在最大吸收波長下的吸光值，即可用朗伯—比爾定律計算出提取液中各色素的含量。

葉綠素a 和葉綠素b 在645nm 和663nm 處有最大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm 處。因此測定提取液在645nm、663nm、652nm 波長下的吸光值，并根據經驗公式可分別計算出葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量。

材料與儀器

植物材料
96％乙醇 丙酮 石英砂 碳酸鈣粉
分光光度計 電子頂載天平 研缽 棕色容量瓶 定量濾紙 吸水紙 擦境紙 滴管 漏斗

步驟

1.取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10mL，繼續研磨至組織變白。靜置3——5min。

2.取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。

3.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至100mL，搖勻。

4.取葉綠體色素提取液在波長665nm、645nm 和652nm 下測定吸光度，以95％乙醇為空白對照。

注意事項

1.光對葉綠素有破壞作用，實驗操作應在弱光下進行，且應盡量在短時間內研磨。

2.色素提取液若混有其他物質而造成渾濁，將影響吸光度的測定，應重新過濾或離心。

3.色素吸光度測定前，應按儀器說明及標準葉綠素 a 、 b 對分光光度計的波長進行校正，否則影響葉綠素含量的測定精度。

常見問題

1.無水乙醇提取時間較長且對某些材料特別是木本植物的葉綠素提取不夠完-全。無水丙酮提取會出現渾濁現象，影響比色測定。因此選用丙酮和無水乙醇混合提取葉綠素的效果較好，比列以2：1效果較佳。

2.傳統的80%丙酮法由于含水量過高，造成葉綠素穩定性差，提取速度慢，測定值偏低，應慎重采用。