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            純化的RNA的點雜交和狹線雜交

            發布時間: 2021-12-21  點擊次數: 1506次

            原理

            點雜交和狹線雜交技術(Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物(通常為帶電荷的尼龍膜)上固定幾種核酸樣品,然后用合適的探針與已固定的樣品雜交,并由此判斷靶序列的濃度。通過估計樣品點發射出 的信號的強度,與已知濃度的標準品信號強度 進行比較,確定待測樣品中靶序列的量。

            材料與儀器

            RNA 檢測樣品、標準品和陰性對照 探針標記與變性
            NaOH 預雜交液 RNA 變性液 SSC
            印跡裝置 絞鏈儀 帶正電荷尼龍膜 厚印透紙 水浴鍋

            步驟

            一、材料

            1. 緩沖液與溶液

            NaOH ( 10 mol/L)

            預雜交液

            RNA 變性液

            0.1X SSC ( 含 0.1% SDS,m/V)

            0.1X SSC ( 含 1%SDS,m/V)

            0.5X SSC ( 含 0.1% SDS,m/V)

            1X SSC ( 含 0.1% SDS,m/V)

            2X SSC

            20X SSC

            2. 核酸與寡聚核甘酸

            RNA 檢測樣品、標準品和陰性對照

            3. 探針

            探針標記與變性

            4. 專用設備

            印跡裝置

            絞鏈儀(如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空爐、微波爐

            帶正電荷尼龍膜

            厚印透紙(如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

            預熱水浴鍋到 68℃

            二、方法

            安裝印跡裝置

            1. 切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標上表示方向的記號。用水把膜簡單弄濕,在 20X SSC 中室溫泡 1 h。

            2. 在膜浸泡期間,先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印跡裝置,再用無菌水洗干凈。

            3. 把兩片厚濾紙用 20X SSC 浸濕,再放到真空器頂部。

            4. 把樣品槽插入裝置的上部,把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部,用吸管在膜的表面滾動以去除膜與裝置夾層中的氣泡。

            5. 加緊夾板,連接真空管。

            6. 加入 10X SSC 直至液面沒過尼龍膜,關掉真空,再用 10X SSC 充滿。

            RNA 樣品準備

            7. 把每個 RNA 樣品(溶解在 10 μl 水)分別與 30 μl RNA 變性液混合。

            8. 65℃ 溫育 5 min,然后在冰上冷卻。

            9. 向每個樣品中加入等體積 20X SSC。

            10. 輕輕向印跡裝置中吸入 10XSSC,直到淹沒尼龍膜。

            RNA 樣品的印跡和 RNA 在膜上的固定

            11. 把所有樣品輕輕加入狹線中,然后輕輕吸干膜。當所有樣品都鋪到膜上后,每個狹線用 1 ml 10XSSC 洗兩次。

            12. 當第二次洗膜完成后,繼續輕輕吸干膜。

            13. 取下膜,然后用紫外交聯、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。

            固定化 RNA 的雜交與洗膜

            14. 把膜放入烤盤或雜交爐中,加入 10~20 ml 預雜交液 68℃ 溫育 2 h。

            15. 把已變性的放射性標記的探針直接加到預雜交液中。在適當的溫度下繼續溫育 12~16 h。

            16. 雜交完后從塑料袋中取出膜,然后盡可能快地把膜轉移到室溫下裝有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。蓋緊塑料容器,放到搖床上輕搖 10 min。

            17. 把膜轉移到另一個裝有 100~200 ml 的、預熱到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中,然后在此溫度下輕搖 10 min。

            18. 按步驟 17 重復洗膜兩次,使總的洗膜次數達到三次。

            19. 用濾紙吸干膜,在 -70℃ 條件下放射自顯影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相當的膠片)。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當然,磷光成像儀也可以用來成像。

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